O sequenciamento de DNA de alto desempenho é uma tecnologia revolucionária na identificação rápida e precisa de agentes infecciosos em amostras clínicas.
As doenças infecciosas são uma das principais causas de morbidade e mortalidade em todo o mundo. Estimativas recentes sugerem que aproximadamente 19% das mortes globais são atribuídas a doenças infecciosas.
As síndromes infecciosas podem apresentar diversas etiologias, isto é, uma infecção pode ser causada por agentes diferentes, o que torna o diagnóstico definitivo extremamente necessário para um tratamento eficaz. A etiologia das infecções muitas vezes permanece sem diagnóstico.
Limitações do diagnóstico microbiológico baseado em cultura para a infectologia
Tradicionalmente, a maior parte do diagnóstico microbiológico depende de métodos de cultivo para identificar o organismo causador de uma infecção e para definir as suscetibilidades aos antimicrobianos. No entanto, esse processo pode levar dias a semanas, e além disso, estima-se que aproximadamente 60% das infecções bacterianas e fúngicas apresentam resultados de culturas negativas.
Vários motivos podem explicar os resultados negativos de uma cultura:
(i) verdadeiro negativo
(ii) terapia antimicrobiana preventiva
(iii) microrganismos não cultiváveis, anaeróbicos ou fastidiosos,
(iv) amostragem, transporte e condições de armazenamento inadequados, e
(v) tempo entre amostragem e cultura.
Diversos estudos mostram que a positividade das culturas pode variar dependendo da condição e do agente etiológico.
São exemplos disso:
Mais de 50% das meningites apresentam culturas de líquor negativas;
Mais de 30% das endocardites possuem hemocultura negativa;
Sensibilidade das hemoculturas para bacteremias é aproximadamente de 60%;
Das infecções em próteses articulares, entre 4-45% apresentam culturas negativas;
Das infecções em implantes cardiovasculares eletrônicos, entre 30-60% apresentam culturas negativas;
Mais de 50% dos casos de sepse grave apresentam culturas negativas.
Impactos negativos do diagnóstico incerto para o tratamento de doenças infecciosas
O diagnóstico incerto resulta em um tratamento tardio ou inadequado, hospitalização prolongada, reinternações, aumento da mortalidade e morbidade e elevado custo para o sistema de saúde. Além disso, a falta da identificação do agente etiológico faz com que o médico inicie um tratamento empírico, muitas vezes com antibióticos de amplo espectro, levando ao maior risco do paciente desenvolver infecção por bactérias multirresistentes, bem como maior chance do paciente internado adquirir uma infecção relacionada à assistência à saúde - IRAS.
Nas infecções graves, foi demonstrado que um intervalo de tempo maior que 1 dia antes do início da terapia antimicrobiana apropriada está associado a um aumento de 2 vezes no risco de mortalidade.
Novas tecnologias complementares, as ômicas
Atualmente, novas técnicas diagnósticas como testes de amplificação de ácido nucleico (por exemplo, reação em cadeia da polimerase - PCR), painéis sindrômicos multiplex (por exemplo, BDMax, FilmArray e outros), ensaios sorológicos, espectrometria de massa com ionização (MALDI-TOF MS) e, mais recentemente, sequenciamento genético de alto desempenho foram incorporados aos laboratórios de microbiologia clínica, com o objetivo de melhorar a identificação do(s) patógeno(s) causador(es) daquela doença.
As metodologias de sequenciamento de alto desempenho, conhecidas como sequenciamento de DNA de nova geração ou NGS, estão cada dia mais presentes em nosso cotidiano, revolucionando a pesquisa biológica em áreas como a genética, genômica, biotecnologia, medicina, etc. Isso porque essa tecnologia permite a análise simultânea de milhões de fragmentos de DNA em uma única reação.
Além disso, podemos observar o incrível aumento na qualidade dos dados gerados, assim como no tamanho de sequências de DNA, ou reads, contando ainda com uma diminuição na quantidade inicial de amostra necessária, além de uma diminuição significativa no custo por base sequenciada. As mudanças que ocorrem neste campo são rápidas e inovadoras, resultando em técnicas de sequenciamento mais robustas e acuradas, além de gerar uma grande quantidade de dados com uma velocidade impressionante.
Uso de sequenciamento de alto desempenho na Infectologia
Na infectologia, o sequenciamento de alto desempenho tem sido amplamente utilizado para identificar patógenos em amostras clínicas, bem como para estudar a diversidade microbiana e as interações entre microrganismos em diferentes ambientes biológicos.
Duas principais metodologias de sequenciamento podem ser utilizadas para se obter resultados de identificação de microrganismos, a partir do DNA presente em uma amostra clínica:
Sequenciamento de amplicon(s) do gene 16S rRNA para identificação de bactérias,
E metagenômica via shotgun.
Veja abaixo o quadro comparativo com as vantagens de ambas as metodologias:
Vantagens do sequenciamento de amplicons do gene 16S rRNA: | Vantagens do sequenciamento metagenômico shotgun: |
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A rápida identificação e caracterização de patógenos microbianos são os principais objetivos de qualquer nova técnica de diagnóstico microbiológico. O diagnóstico rápido e eficaz de um agente infeccioso garantirá a opção de tratamento preciso, otimizando tempo de internação, complicações e custo ao paciente e ao sistema de saúde.
Leia também: “Bioinformática e metagenômica?”
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Fontes:
Christoff, Ana P. Genômica e sequenciamento de nova geração. In TURCHETTO-ZOLET, et
al. Marcadores Moleculares na Era Genômica: Metodologias e Aplicações.São Paulo: Sociedade
Brasileira de Genética, 2017.p.21-50.
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Miao, Qing et al. “Microbiological Diagnostic Performance of Metagenomic Next-generation Sequencing When Applied to Clinical Practice.” Clinical infectious diseases : an official publication of the Infectious Diseases Society of America vol. 67,suppl_2 (2018): S231-S240. doi:10.1093/cid/ciy693