A BiomeHub é uma spin-off da empresa de biotecnologia Neoprospecta, pioneira em análises de microbioma no Brasil, há mais de 10 anos trabalhando com sequenciamento de alto desempenho, também conhecido como NGS - Next Generation Sequencing, de microrganismos.
Atualmente a BiomeHub é uma das principais fornecedoras de testes de microbioma humano, possuindo parceria estratégica e comercial com os maiores laboratórios do Brasil. Além disso, temos orgulho de ser parceiros de pesquisadores das principais instituições acadêmicas do Brasil, hospitais, centros de pesquisa, e farmacêuticas. Isso porque contamos com:
Tecnologias de ponta em genômica, microbiologia molecular e bioinformática.
Equipe multidisciplinar especializada em análises de microbioma.
Metodologias próprias validadas e publicadas.
Etapas desenvolvidas totalmente no Brasil, em infraestrutura própria, aumentando o controle da qualidade de todos os processos, e diminuindo o custo e tempo de entrega dos resultados.
Com uma equipe com larga experiência, tendo processado dezenas de milhares de amostras, construímos um arcabouço de conhecimento e soluções para fazer com que os nossos resultados representem da forma mais fidedigna possível a microbiota das amostras que analisamos, com reprodutibilidade, repetibilidade e robustez.
Confira também as nossas publicações científicas: https://www.biome-hub.com/publicacoes
A seguir, compartilhamos um pouco dos principais pontos críticos e que requerem atenção na hora de definir a metodologia que será escolhida para a realização de estudos.
Coleta e preservação de amostras para análises de microbioma
O maior propósito das análises de microbioma é o de recuperar as informações contidas na amostra no momento certo determinado pelo estudo, ou seja, "tirar uma fotografia" do microbioma no momento da coleta da amostra. Assim, o manuseio adequado das amostras pós-coleta é essencial para evitar a continuidade do crescimento microbiano ou outras distorções que possam ocorrer e enviesar o resultado.
Existem algumas estratégias, como congelamento imediato, armazenamento em -80ºC, entre outras estratégias comerciais, que são necessárias para manter o mais fidedigno possível essa fotografia. A escolha da melhor estratégia dependerá do objetivo do projeto.
Pensando nas principais situações e objetivos dos estudos de microbioma e sabendo do desafio do transporte de amostras de forma a não alterar a composição microbiana original da amostra, a BiomeHub desenvolveu um kit de coleta contendo swab e um tampão estabilizante (Zsample) para manutenção da amostra em temperatura ambiente por até 30 dias.
Esse tampão estabilizante, desenvolvido exclusivamente como parte dos serviços prestados pela BiomeHub, mantém o perfil microbiano da amostra recém coletada reprodutível para amostras mantidas em temperatura ambiente, no tampão, e analisadas em até 30 dias (Figura 1). Esse kit facilita a coleta de diferentes tipos de amostras, de forma simples e rápida, e por poder ser mantida à temperatura ambiente facilita a logística de amostras, tornando os testes de microbioma da BiomeHub acessíveis ao Brasil inteiro, além de gerar resultados reprodutíveis.
Cada coluna é uma coleta independente do mesmo bolo fecal. Os perfis microbiológicos demonstram que há uma consistência dos microrganismos recuperados, em diferentes coletas da mesma amostra, e também ao longo do tempo de armazenamento da amostra em ZSample.
Metodologias de sequenciamento de DNA
A escolha da metodologia de preparo de bibliotecas está intrinsecamente ligada ao tipo de amostra e ao resultado necessário, além do volume de recurso financeiro disponível, pois existem diferenças significativas entre as diferentes abordagens. Entre as principais abordagens estão: sequenciamento de amplicons e metagenômica. Veja a seguir as principais diferenças entre as abordagens.
Sequenciamento de amplicons | Metagenômica |
|---|---|
Abordagem utilizada para o levantamento dos microrganismos presentes em uma amostra utilizando a amplificação de marcadores genéticos específicos, os amplicons. Os mais utilizados são o gene rRNA 16S, usado para identificação de bactérias e arqueas; a região espaçadora ribossomal ITS, usado para identificação de fungos e leveduras, e o gene rRNA 18S, utilizado para identificação de protozoários e outros eucariotos. | Na metagenômica não existe um direcionamento a um grupo de microrganismos específico. Nessa abordagem é realizado o sequenciamento do DNA total da amostra, incluindo o material genético do hospedeiro. Geralmente é utilizada alguma estratégia de preparo de bibliotecas baseada na fragmentação aleatória do DNA para o sequenciamento, também conhecida como shotgun. |
Existem diferenças consideráveis entre as duas abordagens, que vão desde o tipo e o nível de informação possível de ser recuperada em cada uma das estratégias, assim como o custo por análise realizada.
A BiomeHub realiza a identificação de bactérias e fungos por sequenciamento de DNA em larga-escala utilizando abordagens de amplicons ou metagenômica (shotgun). Para a metodologia de amplicons, o sequenciamento de DNA para bactérias é realizado com o marcador molecular 16S rRNA, região V3/V4 e/ou V1/V3, enquanto para fungos utiliza-se o marcador ITS1, referente à região do espaçador interno ribossomal. Já a metodologia de metagenômica (shotgun) é utilizada para análise do DNA total das amostras, em uma abordagem de metagenômica utilizando a estratégia de tagmentação, com os kits Illumina DNA Prep. Dependendo da aplicação do estudo, pode ser realizado sequenciamento single-end, ou paired-end.
Tanto a metodologia de amplicons, quanto a metagenômica (shotgun), retornam a classificação taxonômica dos microrganismos em níveis hierárquicos de classificação, baseada em similaridade das sequências de DNA recuperadas na amostra, comparadas à um banco de dados genômico, além do perfil composicional (%) dos microrganismos presentes na amostra. Ambos os métodos, por amplicon ou shotgun, são capazes de gerar tais resultados, porém eles possuem vantagens e limitações que devem sempre ser avaliadas de acordo com o(s) objetivo(s) pretendido(s) das análises.
Método proprietário de preparo de bibliotecas de DNA para sequenciamento de amplicons
O sequenciamento de alto rendimento de amplicons do gene 16S rRNA é amplamente utilizado em todo o mundo para a caracterização de bactérias que compõem a microbiota. Essa metodologia permite a avaliação do perfil da composição bacteriana diretamente das amostras, sem a necessidade de cultivo bacteriano, e em um único teste. No entanto, na maioria dos protocolos utilizam-se normalizações genéricas, baseadas no total de DNA da amostra ignorando cenários em que a biomassa especificamente microbiana da amostra pode variar amplamente, pois exceto quando isolados por cultivo, amostras complexas não contém apenas o DNA dos microrganismos.
Assim, a BiomeHub desenvolveu e publicou um protocolo equivolumétrico para o preparo da biblioteca de amplicons capaz de gerar dados de sequenciamento responsivos ao input de DNA bacteriano, recuperando a proporcionalidade entre as contagens de sequências observadas e as abundâncias bacterianas absolutas de cada amostra. Com esse método é possível realizar o sequenciamento de DNA de amostras de microbioma mantendo a relação total de unidades formadoras de colônias (UFC) bacterianas na amostra.
Estudos de validação das metodologias
Todos os processos para as análises de microbioma realizados pela BiomeHub foram extensamente validados, tanto laboratoriais, incluindo extração de DNA, e preparo de bibliotecas de sequenciamento de DNA, quanto de bioinformática. Além disso, são realizadas constantes revisões e atualizações científicas sobre os métodos que geram os melhores resultados.
Foram desenvolvidos protocolos in house a partir do conhecimento técnico disponível na literatura científica e os mesmos foram aplicados a amostras de controles externos, isolados e comunidades microbianas (mocks) para avaliação de métricas como sensibilidade e especificidade, tanto dos protocolos de bancada, quanto do método de análise de dados, também desenvolvido pela BiomeHub. Os materiais de referência são mundialmente utilizados, incluindo: BEI Resources, ZymoBiomics, ATCC.
Parâmetros como limite de detecção, precisão e robustez também foram avaliados, tanto em amostras controle, quanto em amostras reais submetidas aos testes de validação do método. Os resultados obtidos demonstram a validade da metodologia utilizada pela BiomeHub nas análises de microbioma humano, tanto para a abordagem de metagenômica, quanto para a de amplicons.
Ainda, são conduzidos pela BiomeHub estudos de Benchmarking dos métodos e análises utilizadas, a fim de buscar sempre o padrão de excelência para os seus processos.
A precisão do método está exemplificada pela figura 2. A reprodutibilidade dos métodos foi avaliada através de ensaio de repetibilidade com diferentes operadores, diferentes materiais e corridas de sequenciamento. Os resultados podem ser vistos com um MA plot comparando os oligotipos gerados por duas corridas de sequenciamento, e variações menores que 3% detectadas para todos os oligotipos em todas as amostras e 11 réplicas por sequenciamento (painel superior à esquerda). No painel superior à direita uma análise de correlação mostra valores acima de 94% para a concordância dos resultados entre réplicas e sequenciamentos. No painel inferior, os índices de diversidade de Shannon ilustram uma grande similaridade entre os perfis dos dois sequenciamentos. Sendo assim, o sequenciamento não é considerado uma fonte de variação relevante para os resultados do ensaio, tendo uma boa reprodutibilidade.
Controle de qualidade dos métodos laboratoriais
Todos os ensaios realizados pela BiomeHub possuem monitoramento e controle de qualidade. Para isso, todos os processos são rastreáveis, padronizados, documentados, e em todas as etapas de processamento são utilizados controles internos de processo. Além disso, a BiomeHub possui um Programa de Avaliação Externa (PAEQ), um programa de avaliação externa alternativa, e um programa de Controle Interno de Qualidade (PCIQ). As amostras controles de cada programa são processadas de forma padronizada, por equipe treinada, conforme os protocolos de ensaios e seguindo Procedimentos Operacionais Padrão (POPs) apropriados e tecnicamente válidos.
No PAEQ, o laboratório da BiomeHub participa de testes de proficiência obtidos de fornecedores credenciados e realiza testes com materiais de referência certificados, os controles externos, para os ensaios baseados em sequenciamento de DNA. Além da validação dos ensaios com controles externos, o laboratório também realiza testes periódicos com materiais de referência comerciais para os ensaios de sequenciamento de DNA.
No PCIQ, o laboratório realiza o monitoramento da qualidade dos ensaios a partir do uso periódico de controles de reação, nos ensaios de PCR em Tempo Real, e nas reações de preparo de biblioteca para sequenciamento. Esses controles de reação são negativos (controles internos negativos de processo) e positivos (controles internos positivos de processo). Além desses controles, é feita uma avaliação periódica da comparabilidade analítica dos ensaios realizados pelo laboratório. Ainda, todos os ensaios que utilizam sequenciadores são avaliados por uma série de métricas analíticas de corrida de sequenciamento para a garantia da validade dos resultados obtidos.
A BiomeHub ainda conta com controle de qualidade e calibração de todos os equipamentos. Os equipamentos são inseridos em um programa de monitoramento, que pode incluir uma verificação/validação do seu desempenho, checagem, calibração, manutenção preventiva e limpeza. Os registros de processamento das análises laboratoriais indicam quais os equipamentos são usados nos procedimentos de ensaio. Dessa forma, com a gestão, monitoramento e registros operacionais de uso de equipamentos, a BiomeHub mantém uma cadeia de rastreabilidade nos procedimentos, e assegura a qualidade dos resultados liberados.
Pipeline de bioinformática para análise de dados
O pipeline de análises compreende os procedimentos de bioinformática realizados para obtenção dos resultados de sequenciamento de DNA em larga escala. Estes procedimentos estão em constante evolução, conforme o conhecimento sobre o assunto aumenta na comunidade científica.
Na BiomeHub os pipelines de análise de bioinformática proprietários são constantemente aprimorados, após extensas avaliações da literatura científica, o que proporciona um melhor aproveitamento dos dados de sequenciamento de DNA, e resultados cada vez mais acurados e sensíveis.
O microbioma humano é composto por uma grande quantidade de bactérias, muitas delas ainda desconhecidas e não caracterizadas pela microbiologia. Contudo, utilizando o pipeline de análises implementado pela BiomeHub é possível identificar o DNA destas bactérias e, por similaridade, classificar as mesmas em algum nível taxonômico que não necessariamente espécie, mas gênero, família ou filo. Isso por que as análises de bioinformática da BiomeHub são validadas ao nível de ASV (amplicon sequencing variant), buscando a melhor resolução taxonômica na classificação dos microrganismos até o nível de espécie - abordagem LCA (lowest common ancestor). Estas informações contribuem para um resultado mais completo e acurado a respeito da diversidade do microbioma que compõe a amostra analisada.
Além disso, para garantir uma melhor acurácia na classificação taxonômica, o banco de dados de análise foi manualmente curado pela BiomeHub e avaliado para inclusão de bactérias com relevância clínica e com sequências de genoma completo caracterizadas.
Estrutura do laboratório e equipe qualificada
A BiomeHub conta com uma área de laboratório de aproximadamente 206m2, com infraestrutura NB2, compreendendo:
Sala técnica para emissão de laudos;
Sala de recebimento de amostras;
Laboratório para manipulação de amostras clínicas e extração de material genético (RNA/DNA);
Laboratório de preparo de reagentes;
Laboratório de amplificação, detecção e sequenciamento.
Além disso contamos com sistema automatizado de extração e pipetagem, equipamento de quantificação fluorimétrica de ácidos nucléicos, termocicladores, PCR em tempo real, dois sequenciadores da plataforma Illumina (MiSeq e NextSeq 1000), um Luminex 200, entre outros. Veja a seguir uma galeria com as imagens da nossa infraestrutura.
A BiomeHub ainda conta com um time altamente qualificado, diverso e multidisciplinar, com colaboradores com formação e competências distintas. E nossa equipe está em constante atualização em em genômica, microbiologia molecular e bioinformática. Assim, conseguimos garantir para nossos clientes e parceiros a melhor experiência em análises de microbioma.
Veja também nosso vídeo manifesto:
Quer saber mais? Entre em contato conosco: https://www.biome-hub.com/pesquisa